Serial Losmen Melati mengisahkan sebuah penginapan. Losmen itu adalah sebuah rumah tua yang terletak di sebuah perkebunan. Tadinya, losmen itu merupakan peninggalan kolonial Belanda yang diubah menjadi penginapan.
Awalnya, losmen ini dimiliki oleh seorang dokter bernama Kusno. Ia merupakan dokter yang mengerjakan eksperimen mengerikan terhadap mayat.
Lalu, datanglah karakter Melati. Ia adalah wanita muda dari desa yang akrab dengan hal gaib dan cerita rakyat. Darinya, terungkap bahwa bangunan dan penghuninya dikutuk oleh arwah orang mati.
Dengan kutukan ini pula, Melati memperoleh kekuatan berupa hidup abadi. Selain itu, ia pun ingin bisa kembali menghidupkan anak laki-lakinya yang sudah tiada.
Selama berpuluh tahun lamanya, Losmen Melati jadi tempat berkumpulnya arwah gentayangan. Melati sendiri mampu merasakan keadaan para tamu serta rasa ketakutan yang dialami oleh mereka. Ternyata, Losmen Melati itu butuh rasa ketakutan tersebut untuk menjadikannya semakin kuat.
Dalam setiap kamar gelap yang ditempati para tamu di losmen itu, mereka bakal dihadapkan dengan rasa ketakutan terbesar. Namun sayangnya, mereka yang sudah masuk tidak akan bisa keluar lagi dari sana.